[Lanjutan] Belum lama ini, zeta potensial, CLSM (confocal laser scanning microscopy) dan teknik fluoresensi mendapat lebih banyak perhatian dari para peneliti dan jadi teknik yang berguna untuk mempelajari adhesi bakteri pada permukaan dalam mulut. Terlepas dari evolusi teknik yang hebat, banyak keterbatasan yang harus dipertimbangkan kala mengevaluasi bahan antimikroba untuk melawan pengembangan biofilm.

Pertama, masih ada kesenjangan lingkungan in vitro dan in vivo. Penelitian-penelitian in situ dapat mengatasi beberapa keterbatasan ini namun kelemahan-kelemahan lainnya tidak dapat dikesampingkan. Sebagian besar penelitian tentang adhesi bakteri ke permukaan dalam mulut dilakukan dalam kondisi in vitro sehingga kurang mencerminkan kehidupan nyata.

Kedua, ada paradoks pengujian sel planktonik namun interpretasi digeneralisasi untuk kondisi pembentukan biofilm. Sudah diketahui dengan pasti bahwa biofilm mengekspresikan gen-gen yang berbeda dari sel-sel planktonik. Selain itu, telah diamati bahwa sel-sel biofilm pada umumnya diyakini sangat mirip dengan sel-sel planktonik dalam fase stasioner. Tetapi, biofilm didapati lebih mirip dengan sel-sel plankton dengan pertumbuhan eksponensial ketimbang sel-sel plankton dalam fase stasioner.

Selain itu, tidak dapat dikesampingkan bahwa ada perbedaan antara biofilm spesies tunggal versus biofilm multispesies karena dalam kondisi laboratorium, monospesies biofilm dapat bertahan 72 jam tanpa gula. Durasi sintasan dapat diperpanjang dengan penambahan mucin, tapi kondisi ini seberapa mirip dengan kondisi mulut mulut pasien yang sebenarnya?

Poin penting yang pungkasan adalah: bagaimana memvalidasi pertumbuhan mikroba? Teknik pewarnaan BacLight hanya mengukur adanya membran utuh dan mungkin tidak berkorelasi dengan kultur atau viabilitas bakteri dari biofilm oral.

Setelah semua poin metodologis yang relevan ini, maka ada semakin banyak tanda tanya bisa berkenaan tentang bagaimana mengevaluasi agen antimikroba terhadap biofilm. Selain mengevaluasi efeknya pada biofilm itu sendiri, kita harus mempertimbangkan pengertian metode yang sesuai yang terkait dengan penggabungan antimikroba ke dalam bahan restorasi gigi ini. Misalnya, konsentrasi substansi antimikroba, volume, atau jumlah bahan yang harus disertakan dan sejauh mana substansi ini dapat mengganggu fitur mekanik dan estetika restorasi.