Pendahuluan

Kelenjar liur mamalia terutama terdiri dari dua macem sel epitel, yaitu:

1. sel asinar yang mensekresikan cairan saliva dan sebagian besar protein saliva,
2. sel duktus yang mensekresikan beberapa protein dan memodifikasi komposisi ion saliva kala mengalirkannya ke dalam mulut.

Karena berbagai alasan, termasuk kepentingan fisiologisnya, kelimpahan relatif dan kemudahan persiapannya, dan respons stimulasi sekresinya yang kuat, sel asinar saliva dipelajari secara intensif dan banyak propertinya telah dimengerti dengan baik, meskipun tentu saja belum sepenuhnya dimengerti.

Meskipun saluran saliva juga sudah mendapat perhatian eksperimental yang cukup besar, terutama dalam 10 tahun belakangan ini, perilaku saliva masih kurang diketahui. Karena prakara ini dan karena peran sentral sel asinar dalam cairan saliva dan sekresi protein, kita akan secara khusus berkonsentrasi tentang prakara tersebut dalam artikel ini. Untuk informasi lebih lanjut tentang saluran saliva, pembaca yang tertarik silakan mengacu pada beberapa ulasan terkini dan rujukannya di dalamnya (Cook et al, 1994; Young and Cook, 1996; Cook et al, 1998).

Perlu juga disebutkan pada poin ini bahwa sebagian besar informasi yang disajikan berikut diperoleh dari kelenjar ludah binatang percobaan (terutama tikus dan kelinci). Kecuali untuk studi morfologi dan beberapa prosedur non-invasif, seperti pengumpulan air liur setelah penerapan berbagai rangsangan, percobaan menggunakan jaringan saliva manusia jarang terjadi. Namun, dalam kasus di mana watak fungsional asini saliva manusia telah diteliti, nampaknya sesuai dengan hasil dan simpulan yang diperoleh dari penelitian pada hewan.

Sekresi cairan saliva

Cara yang paling mudah untuk mengerti usulan mekanisme sekresi cairan saliva adalah dengan mempertimbangkan model spesifik. Gambar 1 menunjukkan representasi skematis sel asinar saliva..

Sel tersebut mengandung empat transporter ion, Na⁺ / K⁺ adenosine triphosphatase (ATPase), Na⁺-K⁺-2Cl- kotransporter dan kanal K⁺ yang diaktifkan dengan Ca²⁺, semuanya terletak di membran basolateral, dan saluran Cl- yang diaktifkan Cl2 terletak di membran apikal. Sekresi cairan diduga timbul dari aksi terpadu keempat transporter itu sebagai berikut.

Na⁺/ K⁺ ATPase mempertahankan konsentrasi Na⁺ intraseluler tetap rendah dan konsentrasi K⁺ intraseluler tinggi, relatif terhadap interstitium dengan bertukar 3Na⁺ untuk 2K⁺ dengan biaya adenosin trifosfat (ATP) seluler. Na⁺ -K⁺ -2Cl- kotransporter (juga dikenal sebagai NKCC1) adalah sistem transportasi aktif sekunder yang mengangkut 1Na⁺, 1K⁺ dan 2Cl^- ke dalam sel dengan caradigabungkan rapat.

Karena gradien Na⁺ dari ekstraselular ke intraselular yang dipertahankan oleh Na⁺ / K⁺ ATPase, Cl^- juga terkonsentrasi di sitoplasma asinar di atas ekuilibrium elektrokimia oleh NKCC1. Dalam keadaan rehat (tanpa stimulasi), konsentrasi Ca²⁺ intraseluler rendah dan saluran K⁺ dan Cl^- yang diaktifkan oleh Ca²⁺ karena itu ditutup. Tapi ketika sel distimulasi oleh sekretagog (in situ, biasanya agonis muskarinik asetilkolin) konsentrasi Ca²⁺ intraselular meningkat dan saluran K⁺ dan Cl^- terbuka.

Perubahan-perubahan yang terkait dengan Ca²⁺ dalam konduktansi K⁺ dan Cl^- memungkinkan KCl mengalir keluar dari sel sehingga terjadi akumulasi ion-ion Cl^- dan muatan listrik negatif yang terkait pada lumen acinar. Na⁺ kemudian diperkirakan mengikuti Cl^-dengan bocor dari interstitium melalui persimpangan yang ketat antar sel-sel untuk mempertahankan elektronetralitas, dan gradien osmotik yang dihasilkan untuk NaCl menyebabkan pergerakan air transepitel dari interstitium ke lumen.

Dengan adanya sekretagog secara terus-menerus, fluks Cl^- transepithel bersih dan sekresi cairan secara bersamaan dipertahankan sebagai hasil dari entri Cl^- melalui NKCC1 dan keluar melalui saluran Cl^- apikal. Ketika stimulus dihilangkan, konsentrasi Ca²⁺ intraseluler turun ke level rehat, saluran K⁺ dan Cl^- menutup, dan sel kembali ke keadaan rehatnya.

Seperti yang telah dibahas lebih rinci di bawah ini, bukti eksperimental cukup menunjukkan bahwa mekanisme yang disajikan pada Gambar 1 dapat menjelaskan sebagian besar sekresi ludah dari tikus, kelinci dan kelenjar liur mayor manusia. Namun, ada juga bukti bahwa dua mekanisme alternatif yang didasarkan pada prinsip kopling osmotik yang sama yang diuraikan pada Gambar 1 (yaitu transport anion transepitel yang mendorong sekresi garam diikuti oleh air yang mengandung osmotik) juga dapat memberikan kontribusi yang signifikan terhadap sekresi cairan saliva.

Yang pertama dari prakara ini berbeda dalam prakara langkah masuk Cl^-. Di sini, NKCC1 diganti dengan penukar Cl^- / HCO^3- dan penukar Na⁺ / H⁺ (Gambar 2a). Dalam model ini, penurunan konsentrasi Cl^- intraselular yang dihasilkan dari kehilangan KCl yang diinduksi oleh sekretagog menghasilkan peningkatan entri Cl^- melalui penukar Cl^-/ HCO^3-. HCO^3- kemudian diganti dengan difusi CO₂ ke dalam sel dan dikonversi menjadi HCO^3- plus H⁺ oleh karbonat anhidrase (CA). Sesudah itu, H⁺ dipompa keluar dari sel oleh penukar Na⁺/ H⁺ menggunakan gradien Na⁺ dari ekstraselular ke intraselular yang dihasilkan oleh Na⁺ / K⁺ ATPase. Hasil bersihnya adalah pergerakan NaCl ke dalam sel sebagai ganti  CO₂. Hal ini bisa mendaur ulang seluruh membran basolateral.

Mekanisme alternatif lainnya (Gambar 2b) melibatkan sekresi HCO^3-  ketimbang Cl^-. Disini CO₂ memasuki sel asinar dengan melintasi membran basolateral dan diubah menjadi HCO^3- plus H⁺ oleh CA intraselular. HCO^3- disekresikan melintasi membran apikal melalui saluran anion, mungkin saluran yang sama terlibat dalam sekresi Cl^-, dan H⁺ diekstrusi oleh penukar Na⁺ / H⁺ basolateral. Data terbaru menunjukkan bahwa kotransporter Na⁺ - HCO^3- basolateral juga bertanggung jawab atas beberapa entri HCO^3- (Roussa et al, 1999) meskipun prakara ini masih agak spekulatif.

Singkatnya, data yang ada dari keseluruhan penelitian hewan, kelenjar perfusi, asinar terisolasi, dan membran plasma asinar menunjukkan bahwa semua sistem transportasi membran yang diilustrasikan pada Gambar 1 dan 2 ada dalam sel asinar saliva dan berfungsi dengan cara yang sesuai dengan yang disarankan untuk mekanisme sekresi cairan. Selain itu, data juga memberi bukti yang bisa dipercaya bahwa mekanisme ini dapat menjelaskan sekresi cairan yang diamati.

Seperti telah disinggung di atas, sekresi cairan saliva nampaknya merupakan proses dua tahap seperti yang pertama kali diusulkan oleh Thaysen, Thorn dan Schwartz (1954). Artinya, saliva pada mulanya terbentuk sebagai sekresi primer seperti plasma isotonik di lumen asinar (tahap pertama). Maka, saluran saliva memodifikasi cairan primer ini dengan mengeluarkan natrium dan klorida dan menambahkan kalium dan bikarbonat untuk menghasilkan cairan hipotonik final yang masuk ke dalam mulut Komposisi ionik plasma seperti saliva primer telah dikonfirmasi dengan menganalisis kandungan elektrolit cairan yang dikumpulkan dari lumen asinar dengan menggunakan teknik mikropuncture (Young and Cook, 1996; Martinez, 1987).

Properti saliva primer ini secara umum sesuai dengan operasi beberapa kombinasi mekanisme sekretori yang dibahas di atas dan dengan pandangan yang berlaku bahwa transport fluida osmotik biasanya mendekati isotonik karena permeabilitas air yang relatif tinggi dari epitel pengangkutan fluida (Spring, 1999). Impermeabilitas saluran saliva untuk air dan kemampuannya untuk memodifikasi komposisi ionik cairan primer sesuai kebutuhan juga telah dikonfirmasi (Martinez, 1987; Young and Cook, 1996).

Serangkaian percobaan dengan kelenjar submandibular tikus dan kelinci yang dilakukan pada tahun 1980an sangat penting dalam memfokuskan perhatian eksperimental pada mekanisme yang dibahas di atas (lihat Turner, 1993 untuk tinjauan lebih rinci dan referensi khusus). Studi ini menunjukkan bahwa sekresi air liur yang diinduksi acetylcholine berkurang tajam (~ 70%) kala Cl^- diganti dalam perfusat penuh Cl- / HCO^3- oleh anion inert fisiologis, atau bila penghambat NKCC1 ada dalam perfusat.

Efek penghambat NKCC1 bahkan lebih dramatis lagi pada media bebas HCO^3- dimana penghambatan sekresi cairan > 95%. Hasil ini bila diperhitungkan serentak dengan data pendukung lainnya sangat menyarankan agar mekanisme yang diilustrasikan pada Gambar 1 bertanggung jawab atas sebagian besar sekresi cairan. Selain itu, sekresi residu yang diamati dalam media bebas Cl^- tapi penuh HCO^3- adalah kaya HCO3 dan diblokir oleh penghambat CA atau penukar Na⁺ / H⁺.

Komponen sekresi cairan ini konsisten dengan adanya mekanisme yang digambarkan pada Gambar 2b. Pengamatan lain yang kurang langsung menunjukkan operasi mekanisme yang diilustrasikan dalam Gambar 2a juga. Pada kelenjar submandibular tikus, Pirani et al. (1987) memperkirakan bahwa mekanisme yang diilustrasikan pada Gambar 1, 22a dan b berkontribusi terhadap sekresi anion dan dengan demikian sekresi cairan dalam rasio 16: 3: 2.

Meskipun ada bukti yang bisa dipercaya bahwa ketiga mekanisme yang dibahas di atas memberi kontribusi yang signifikan terhadap cairan yang disekresikan oleh submandibular kelinci , kelenjar submandibular tikus, dan kelenjar tikus, ini tidak berlaku untuk semua kelenjar ludah. Jadi, misalnya, mekanisme yang ditunjukkan pada Gambar 2a dan b nampaknya sedikit berperan jika ada dalam sekresi cairan dari kelenjar labial manusia (Paulais et al, 1996), sementara mekanisme yang ditunjukkan pada Gambar 2b hanya berlaku pada parotid sapi ( Lee dan Turner, 1993). Pengamatan Lee & Turner ini konsisten dengan pengamatan bahwa air liur ruminansia mengandung kadar bikarbonat yang sangat tinggi (≈100 mM) yang diperlukan untuk menyangga asam yang dihasilkan oleh fermentasi mikroba dalam rumen.

Alasan untuk adanya tiga mekanisme sekresi cairan pada kelenjar yang sama masih belum jelas. Selain itu, agak mengejutkannya, ada bukti yang menunjukkan bahwa ada banyak mekanisme dan mekanisme-mekanisme tersebut hidup berdampingan dalam sel asinar yang sama (Turner dan George, 1988; Lee and Turner, 1991). Ada kemungkinan sel tersebut mampu memodulasi kontribusi dari berbagai mekanisme sesuai dengan keadaan fisiologis tertentu, misalnya periode aliran saliva yang singkat dan berkelanjutan. Tapi kala ini tidak ada bukti yang kokoh bahwa prakara seperti ini terjadi.

Dalam makalah yang relatif baru, Evans et al (2000) meneliti sekresi saliva pada tikus dimana gen untuk NKCC1 telah diganggu dan ekspresi protein ini tidak dapat dideteksi. Stimulasi laju alir saliva pada tikus KO NKCC1 hanya 40% dari jumlah yang diamati pada kelompok littermates normal. Menariknya, penulis tersebut juga menemukan bahwa aktivitas penukar Cl^-/ HCO^3- meningkat pada sel-sel asinar parotid dari tikus KO NKCC1. Hal ini menunjukkan bahwa sekresi cairan melalui mekanisme yang ditunjukkan pada Gambar 2a meningkat pada hewan-hewan ini guna mengkompensasi hilangnya NKCC1.

Selain aliran air liur yang berkurang, tikus KO NKCC1 juga menunjukkan sejumlah kelainan lainnya. Kelainan yang paling dramatis adalah tuli karena kerusakan labirin membran telinga bagian dalam (Delpire et al, 1999; Flagella et al, 1999 ) dan infertilitas jantan karena spermatogenesis yang cacat (Pace et al, 2000). Kedua perkara ini diperkirakan terjadi karena kerusakan cairan sekresi cairan di masing-masing jaringan.

Mekanisme yang diilustrasikan pada Gambar 1 dan Gambar 2 tidak membahas pertanyaan apakah air yang mengikuti aliran sekresi garam antara sel (melalui persimpangan yang ketat) atau melalui sel tubuh (melalui sitoplasma). Sebenarnya, perkara ini telah menjadi sumber minat dan eksperimen yang cukup besar dalam epitel sekresi dan absorsi selama bertahun-tahun (Spring, 1999).

Dalam asini saliva permasalahan ini dibuat jadi lebih rumit dengan bentuk piramida sel asinar yang menghasilkan area agak kecil untuk membran luminal maupun kompleks jungsi yang rapat. Jadi, rute mana pun yang dilalui oleh air tentu memerlukan permeabilitas air yang relatif tinggi. Tonggak utama dalam penyelesaian perkara ini adalah penemuan dan kloning aquaporins, keluarga protein saluran air membran plasma (Borgnia et al, 1999).

Telah diketahui selama beberapa waktu bahwa membran banyak sel memiliki permeabilitas air yang sangat tinggi, sementara membran yang lain relatif tidak tembus air (misalnya membran luminal saluran air liur, lihat di atas) dan yang lainnya dapat mengatur permeabilitas airnya sesuai kebutuhan ( Borgnia et al, 1999).

Sekarang jelas bahwa membran sel memiliki permeabilitas air intrinsik yang sangat rendah dan bahwa permeabilitas air yang besar yang diamati pada membran banyak jaringan dikarnakan oleh adanya aquaporins. Anehnya, penelitian-penelitian pertama gagal menunjukkan adanya aquaporins pada selaput membran acrium saliva, namun kemudian ditemukan bahwa isoform aquaporin baru, yaitu AQP5, dilokalisasi ke membran apikal banyak epitel sekresi, termasuk sel saliva saliva (Raina et al, 1995).

Percobaan yang lebih baru telah menunjukkan bahwa aliran saliva yang dirangsang berkurang lebih dari 60% pada tikus KO AQP5 relatif terhadap kontrol normal (Ma et al, 1999). Dengan demikian, terlihat bahwa sebagian besar air, tapi mungkin tidak semua air, yang disekresikan mengalir melalui sel-sel asinar.

Konsisten dengan peran sentralnya dalam sekresi cairan saliva, aktivitas NKCC1 telah terbukti secara dramatis ditingkatkan regulasinya oleh sekretagog. Evans dan Turner (1997) menunjukkan peningkatan 20 kali lipat aktivitas pengangkutan NKCC1 pada sel asinar parotid tikus setelah penerapan rangsangan lain yang memobilisasi muskarinik dan Ca²⁺.

Efek ini tampaknya dimediasi oleh metabolit asam arachadonic (Evans dan Turner, 1997) namun mekanisme yan pasti masih belum dipastikan. Pengamatan ini konsisten dengan gagasan bahwa aktivitas NKCC1 sedang diturunkan regulasinya sementara sel rehat untuk mencegah siklus transporter yang tidak disengaja, kemudian ditingkatkan regulasinya selama stimulasi kala aktivitasnya diperlukan.

Menariknya, pada parotid tikus, NKCC1 juga diaktifkan meskipun dengan tingkat yang lebih rendah, oleh stimulasi β-adrenergik (Paulais dan Turner, 1992) yang menaikkan tingkat cAMP intraselular tanpa mempengaruhi konsentrasi Ca²⁺ intraselular. Hal ini terjadi karena adanya fosforilasi NKCC1 yang melibatkan (namun tampaknya tidak secara langsung dikarenakan oleh) protein kinase A (PKA) yang bergantung pada cAMP (Tanimura et al, 1995; Kurihara et al, 1999).

Sekilas, tampaknya aneh bahwa NKCC1 akan naik regulasinya dengan stimulus seperti itu karena, seperti yang dibahas di bawah ini, peningkatan konsentrasi cAMP intraseluler menghasilkan sekresi protein acinar yang kuat namun biasanya menghasilkan sedikit cairan saliva. Tapi, ada bukti bagus bahwa stimulasi simpatis (adrenergik) yang timbul misalnya dari pengunyahan, bila ditumpangkan pada stimulasi parasimpatis (muskarinik), memiliki efek sinergis pada aliran air liur (Johnson, 1987).

Efek sinergis ini mungkin timbul dari kenaikan regulasi NKCC1 yang dependen cAMP. Juga menarik untuk berspekulasi bahwa gejala mulut kering (xerostomia) yang tidak dapat dijelaskan dan gejala mata kering yang menyertai penggunaan banyak obat yang diresepkan secara umum (Sreebny dan Schwartz, 1986) mungkin terkait dengan gangguan regulasi NKCC1 yang diinduksi oleh sekretagog. Memang, di antara obat-obatan ini ada sejumlah penghambat β (Sreebny dan Schwartz, 1986).

Yang pungkasan, kita harus menyebutkan bahwa, meskipun hipotesis kopling osmotik (bahwa air mengikuti sekresi garam secara osmotik) yang mendasari model pada Gambar 1 dan 2 telah diterima secara luas di antara pakar fisiologi, ada beberapa pandangan yang berbeda (Whittembury and Hill, 2000). Salah satu perkara utama di sini adalah bahwa prakara itu belum memungkinkan, untuk kala ini, untuk secara eksperimental menunjukkan adanya gradien osmotik antara interstitium dan lumen yang diperlukan untuk berfungsinya model. Dalam prakara model kopling osmotik, penjelasan untuk perkara ini adalah bahwa, karena permeabilitas air yang tinggi dari epitel, hanya gradien yang sangat kecil yang diperlukan untuk memperhitungkan fluks air yang diamati (Spring, 1999). Masalah untuk perbedaan pandangan, perbedaan pandangan yang besar menurut pendapat kami, adalah menjelaskan banyak bukti yang ada yang konsisten dengan hipotesis gradien osmotik tidak hanya di kelenjar ludah tetapi juga di banyak epitel sekresi dan absortif lainnya.

Sekresi protein saliva

Saliva mengandung berbagai macam protein yang disekresikan, termasuk: α-amilase, enzim yang terlibat dalam pencernaan pati; lysozyme, peroxidase, immunoglobulin (IgA) dan banyak protein tambahan yang memiliki watak antibakteri dan / atau antivirus; dan mucin, yaitu glikoprotein multifungsi yang terlibat dalam perlindungan mekanis dan pencegahan dehidrasi epitel oral, dan juga pelumasan untuk makanan padat dan perangkap mikroorganisme (Young and Cook, 1996; Amerongen & Veerman in press). Seperti yang telah ditunjukkan, sebagian besar protein dalam saliva disekresikan oleh sel asinar.

Protein saliva menunjukkan transport vektorial dari retikulum endoplasma kasar di mana mereka disintesis melalui serangkaian kompartemen yang dibatasi membran termasuk kompleks Golgi, vakuola kondensasi, dan granula sekretori (Von Zastrow and Castle, 1987). Granula sekretori bermigrasi ke lokasi tertentu di dalam sel yang dekat dengan membran apikal sebelum pelepasan isinya ke dalam lumen acinar.

Exositosis adalah proses yang dipakai oleh sel untuk melepanyaskan isi granula sekretori mereka. Hal ini melibatkan perpaduan membran granula dengan membran plasma luminal sel sekretori yang diikuti dengan pecahnya selaput fusi. Proses ini berlanjut di sebagian besar sel (exositosis konstitutif), namun dapat sangat dipercepat setelah sinyal seluler yang sesuai seperti stimulasi saraf (exositosis regulatory).

Pada tiga kelenjar saliva utama (parotid, submandibula, sublingual), sekresi protein eksositosis terutama dikendalikan oleh sistem saraf otonom. Stimulasi simpatik memunculkan pelepasan protein dari asini kelenjar submandibular dan parotid, dan stimulasi parasimpatis memunculkan pelepasan protein dari asini kelenjar sublingual serta beberapa pelepasan dari asini parotid (Quissell dan Tabak, 1989; Spearman dan Butcher, 1989). Kami akan fokus di sini pada sekresi amilase dari sel asinar parotid tikus karena penelitian terbaru mengenai sistem ini meningkatkan pengertian yang lebih baik tentang kejadian seluler yang terlibat dalam eksositosis kelenjar ludah.

Sekresi amilase dependen cAMP

Sekresi protein saliva, seperti sekresi cairan, ditimbulkan kala neurotransmitter mengikat reseptor spesifik pada membran basibateral sel sekretori dan menghasilkan messenger intraseluler kedua yang pada gilirannya mengaktifkan mekanisme seluler yang bertanggung jawab atas sekresi. cAMP adalah messenger primer kedua untuk sekresi amilase dari sel asinar parotid tikus (Butcher dan Putney, 1980).

Noradrenalin yang dilepaskan dari saraf simpatis mengikat dan mengaktifkan reseptor β-adrenergik yang menghasilkan kenaikan kadar cAMP intraselular. cAMP dianggap memediasi sebagian besar pengaruhnya melalui pengaktifan protein kinase yang dependen pada cAMP, juga dikenal sebagai PKA. Dalam sel-sel asinar parotid, aktivasi PKA sangat penting untuk sekresi eksositosis dependen cAMP (Quissell, 1993; Takuma dan Ichida, 1994). Namun, target protein yang difosforilasi oleh PKA belum diidentifikasi.

Berbeda dengan asini parotid tikus, pada banyak sel sekresi lainnya, Ca²⁺ telah ditemukan jadi messenger intraseluler primer kedua untuk eksositosis. Tetapi telah ditunjukkan bahwa cAMP memediasi sekresi amilase parotid tanpa peningkatan Ca²⁺ sitosolik (Takuma dan Ichida 1986). Selain itu, sel asinar permeabilisasi yang secara signifikan meningkatkan pelepasan amilase teramati pada semua konsentrasi uji Ca²⁺ bebas (Baldys-Waglegorska et al, 1987).

Sekresi amilase dependen Ca²⁺

Stimulasi reseptor muskarinik, peptidergik substansi P atau reseptor α-adrenergik juga menghasilkan pelepasan amilase yang signifikan dari parotid tikus, meskipun pada tingkat yang secara signifikan lebih rendah daripada yang diamati dari tanggapan mediator adrenotometri β-adrenergik. Reseptor ini diaktifkan oleh asetilkolin dan substansi P yang dilepaskan dari saraf parasimpatis, dan oleh noradrenalin yang dilepaskan dari saraf simpatis. Stimulasi reseptor ini mengaktifkan metabolisme fosfatidylinositida dan menginduksi peningkatan konsentrasi Ca²⁺ intraselular tanpa mempengaruhi tingkat cAMP intraselular (Butcher dan Putney, 1980; Sugiya dan Furuyama, 1989).

Docking/priming dan fusi

Yoshimura et al (Yoshimura dan Nezu, 1992; Yoshimura, Hiramatsu dan Murakami, 1998, Yoshimura, Murakami dan Segawa, 2000) telah mengembangkan sistem perfusi untuk sel asinar parotid tikus terisolasi yang memungkinkan seseorang untuk mendapat alur waktu terperinci untuk pelepasan amilase. Mereka menunjukkan bahwa aktivasi jalur pensinyalan cAMP oleh agonis β-adrenergik menghasilkan kenaikan tingkat sekresi amilase secara bertahap.

Di sisi lain, aktivasi reseptor mobilisasi Ca²⁺ memicu perubahan bifase dalam pelepasan amilase yang terdiri dari puncak besar di permulaan tapi transien yang diikuti dengan datar rendah yang terus-terusan. Dengan tidak adanya Ca²⁺ ekstraselular, hanya puncak transien purwa yang terlihat. Waktu pelepasan amilase ini paralel dengan respons agonis yang diinduksi pada konsentrasi Ca²⁺ intraselular yang menunjukkan bahwa Ca²⁺ dapat memainkan peran penting dalam pengaturan sekresi amilase.

Selanjutnya, rangsangan gabungan dari jalur mobilisasi cAMP dan Ca²⁺ menghasilkan respons yang lebih besar daripada jumlah respons yang diinduksi oleh setiap stimulus saja. Analisis yang lebih rinci yang dibahas di bawah ini menunjukkan bahwa efek sinergis ini dikarenakan peningkatan potensial dan kemanjuran proses yang diinduksi cAMP  dan diregulasi oleh Ca²⁺.

Telah ditunjukkan bahwa exositosis neurotransmitter yang teregulasi dapat dibagi menjadi tiga tahap:

1. pemasangan vesikula ke membran plasma
2. peristiwa `priming' yang disertai hidrolisis ATP
3. fusi / sekresi yang dipicu oleh peningkatan konsentrasi Ca²⁺ intraselular (Südhof, 1995).

Yoshimura et al, (1998) menghipotesiskan bahwa Ca²⁺ memicu proses fusi final untuk pelepasan amilase parotid dan bahwa cAMP merangsang pembentukan granula sekretori docked (berlapis)/ primed sehingga meningkatkan efek Ca²⁺ sebagai pemicu fusi (Gambar 3).

Fujita-Yoshigaki (2000) mengkonfirmasi bahwa data eksperimen tentang pelepasan amilase dari parotid tikus dapat dipertanggungjawabkan dengan model semacam itu. Lebih spesifik lagi dia memodelkan pelepasan amilase sebagai dua reaksi orde pertama, yang pertama mewakili docking priming (tergantung cAMP) dan yang kedua merepresentasikan fusi granula sekretori (dependen Ca²⁺).

Analisis data eksperimental Yoshimura et al (1998) dengan model ini menunjukkan bahwa jumlah granula docked primed cukup sedikit pada sel yang tidak distimulasi. Dengan demikian, pelepasan amilase yang cukup besar dapat ditimbulkan oleh stimulus penghasil cAMP bahkan pada kadar rehat Ca²⁺ intraselular, terhitung untuk pengamatan bahwa pelepasan amilase nampaknya terutama bergantung pada cAMP.

Perlu juga ditekankan bahwa stimulasi in vivo β-adrenergik (yang menghasilkan cAMP) terjadi karena noradrenalin yang juga menghasilkan stimulasi reseptor α-adrenergik (mobilisasi Ca²⁺), sehingga sel asinar selalu mengalami peningkatan konsentrasi Ca²⁺ intraselular bersamaan dengan yang dari cAMP.

Keterlibatan protein-protein SNARE dalam sekresi amilase

Untuk sel-sel neuron, Söllner et al (1993a, b) mengajukan hipotesis `SNARE ', yaitu bahwa vesikula sinaptik menempel pada membran target melalui interaksi protein membran vesikel dan target yang disebut reseptor SNAPs (SNAREs). VAMP2 adalah SNARE yang terkait vesikula (v-SNARE), dan syntaxin 1 dan SNAP-25 adalah SNAREs membran target (t-SNAREs).

Fujita-Yoshigaki et al (1996) mengidentifikasi protein 18 kDa yang dilokalkan ke membran granula sekretor dari sel asimetotase parotid tikus sebagai VAMP-2 dengan menunjukkan bahwa prakara itu bereaksi dengan antibodi terhadap VAMP2 dan dibelah oleh botulinum neurotoksin B, metaloprotease spesifik untuk VAMP2. Pada sel-sel asinar parotid tikus yang dipermeabilisasi dengan streptolysin O, para pengarang tersebut juga menunjukkan bahwa botulinum neurotoxin B menghambat pelepasan amilase yang diinduksi oleh cAMP, namun bukan pelepasan yang diturunkan dari Ca²⁺. Hal ini menunjukkan bahwa VAMP-2 terlibat dalam exocytosis amilase yang dimediasi cAMP sebagai v-SNARE (Fujita-Yoshigaki et al, 1996). Pada sel-sel asinar parotid, t-SNAREs seperti syntaxin 1 dan SNAP-25 yang ditemukan di sel neuronal tidak terdeteksi. Pada sel-sel non-neuron, syntaxin 4 dan SNAP-23 adalah kandidat yang masuk nalar untuk t-SNAREs. Kedua protein ini terdeteksi pada sel asinar parotid tikus, namun tidak di-koimunopresipitasi dengan VAMP2. Hal ini menunjukkan bahwa interaksi mereka dengan VAMP2 mungkin lemah (Takuma, Arakawa dan Tajima, 2000).

Fujita-Yoshigaki et al (1999) mempelajari imunopresipitasi VAMP-2 menggunakan antibodi poliklonal kelinci yang diajukan terhadap peptida yang sesuai dengan Arg47-Asp64 dari VAMP-2. Wilayah VAMP-2 ini tumpang tindih dengan domain yang terlibat dalam pengikatan t-SNAREs.

Antibodi ini mampu mengimunisasi kembali VAMP-2 dari membran granula sekretori parotid tikus yang terlarut dan yang disiapkan dari sel yang tidak distimulasi dan yang diinkubasi dengan adanya cAMP dan acinar sitosol, namun tidak tanpa adanya inhibitor PKA dan imunopresipitasi ini dicegah oleh H89.

Pengamatan ini menunjukkan bahwa situs pada VAMP-2 dimana antibodi dinaikkan tersembunyi pada sel yang sedang rehat dan bahwa PKA dapat memisahkan kompleks ini melalui fosforilasi beberapa protein sitosol (Gambar 4). Dua protein 35 dan 80 kDa yang ditemukan ber-koimunopresipitasi dengan VAMP2 (Takuma et al, 2000) adalah kandidat potensial untuk protein ini, namun penelitian tambahan diperlukan untuk memastikan prakara ini dan juga identitasnya.

Keterlibatan protein pengikat GTP dalam sekresi amilase

Ada dua kelompok protein pengikatan GTP yang telah diketahui terlibat dalam peristiwa transduksi sinyal, protein pengikat GTP yang 'heterotrimerik' yang memiliki peran terdokumentasi dengan baik dalam interaksi kopling reseptor, dan protein pengikat GTP 'monomer' atau 'kecil ' yang kita bahas disini. Protein pengikat GTP kecil memiliki massa molekul dalam kisaran 18-30 kDa. Berbeda dengan protein pengikat GTP heterotrimerik, Protein pengikat GTP kecil terdiri dari satu subunit tunggal dan memiliki protein pengaktif GTPase spesifik yang meningkatkan aktivitas GTPase intrinsik-nya. Protein pengikatan GTP kecil dikelompokkan menjadi lima kelompok, yaitu: Ras, Rab, Arf, Rho, dan Ran.

Spesies-spesies ini terlibat dalam diferensiasi sel, sekresi, trafficking membran antara retikulum endoplasma dan aparatus Golgi, pengorganisasian mikrofilamen, dan transport protein ke dalam nukleus. Baru-baru ini ada usulan bahwa protein pengikat GTP kecil terlibat dalam proses eksositosis dalam sel sekretori, termasuk sel asinar parotid (Watson, 1999).

Protein Rap adalah anggota subfamili Ras. Protein rap dibagi menjadi dua subkelompok, yaitu: Rap1 dan Rap2. Rap1 telah diidentifikasi pada membran granula sekretori, membran plasma dan sitosol sel asimeter parotid tikus (Kameyama et al, 1994; D'Silva et al, 1997) dan telah diamati melakukan translokasi terhadap sitosol setelah aktivasi reseptor β-adrenergik ( D'Silva et al, 1998).

Sekitar 40 protein Rab telah terbukti terlibat dalam penargetan dan peleburan vesikel transportasi dengan membran akseptor di berbagai jaringan dan spesies (Martinez dan Goud, 1998). Empat isoform Rab3 telah dikloning. Rab3D telah diidentifikasi pada membran granula sekretori, membran plasma dan sitosol sel asinar parotid tikus dan, seperti aktivasi reseptor Rap1, β-adrenergik telah ditunjukkan untuk menginduksi redistribusi Rab3D dari sitosol ke fraksi membran (Raffaniello et al, 1999). Protein Rab yang lain, yaitu Rab26, terbukti terlokalisir ke granula sekretori pada sel asinar parotid tikus dan imunostaining Rab26 menghilang dari sel asinar setelah stimulasi reseptor β-adrenergik (Yoshie et al, 2000).

Arf, faktor ribosilasi ADP, pada mulanya dicirikan sebagai kofaktor untuk ribosilasi ADP yang dikatalisis oleh toksin kolera. Sekarang, enam isoform Arf telah diidentifikasi dan dikenal sebagai faktor multifungsi yang terlibat dalam sejumlah kejadian biologis seperti trafficking membran, eksositosis dan endositosis (Boman dan Kahn, 1995).

Dohke et al (1998) menyelidiki kemungkinan keterlibatan Arf dalam eksositosis sel asinar parotid tikus. Penelitiannya menunjukkan bahwa Arf1 terutama terdeteksi pada fraksi sitosolik sel-sel ini dan bertranslokasi ke membran granula sekretori dengan cara yang tergantung pada GTP. Selanjutnya, peptida dari ujung N Arf1 menghambat sekresi amilase yang diinduksi cAMP bila ditambahkan ke sel parotid tikus yang dipermeabilitasi (Dohke et al, 2000).

Pengamatan di atas sangat menyarankan keterlibatan protein pengikat GTP kecil dalam eksositosis amilase yang teregulasi dari sel asinar parotid adrenal. Peran yang mungkin untuk protein-protein ini yang didasarkan pada pengamatan dari jaringan lain ditunjukkan di bawah ini:

(i) Protein-protein rab bersiklus antara keadaan terikat PDB sitosolik dan keadaan terikat GTP vesikular dengan bantuan banyak protein aksesori. Siklus yang berulang antara membran vesikel dan sitosol dapat dihasilkan melalui pertukaran PDB / GTP. Pada sel neuron, protein Rab3A dianggap sebagai regulator rakitan kompleks SNARE (Lin dan Scheller, 2000).

(ii) Reorganisasi sitoskeletal merupakan langkah penting dalam eksositosis. Segawa et al (1998) mengusulkan peran sitoskeleton pada eksositosis pada kelenjar ludah. Pada trombosit manusia, asosiasi protein Rap1 dengan sitoskeleton telah disarankan terlibat dalam eksositosis melalui reorganisasi sitoskeletal (Fisher et al, 1990).

(iii) Fusi membran dapat dimodifikasi dengan perubahan komposisi lipida membran. Asam fosfatidat bisa menjadi lipida fusogenik. Dalam sel chromaffin, Arf6 terkait dengan granula sekretori yang mentransmisikan membran plasma pada stimulasi sel, menghasilkan aktivasi fosfolipase D (Caumont et al, 1998) dan produksi asam fosfatidatnya. Dampaknya, lipida fusogenik yang dihasilkan di situs eksositosis tampaknya terlibat dalam eksositosis. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) juga dianggap sebagai regulator eksositosis. Pada sel mast, Arf1 telah terbukti berkontribusi pada aktivasi exositosis mengikuti reseptor IgE cross-linking dengan mengatur tingkat PIP2 melalui mekanisme yang belum sepenuhnya dimengerti (Way, O'luanaigh dan Cockcroft, 2000).

Protein pengikat GTP kecil dapat memiliki peran serupa (selain yang belum teridentifikasi) dengan peran yang diketahui di atas dalam sekresi protein dari sel asin saliva.

Apa peran tepat protein seperti SNAREs dan protein pengikat GTP kecil dalam eksositosis dari sel kelenjar ludah masih perlu untuk diteliti. Sejumlah teknik baru dan menarik kala ini tersedia untuk menjawab pertanyaan-pertanyaan ini.

Contohnya termasuk antibodi spesifik lokasi dan antibodi lainnya, oligonukleotida antisense yang mengikat untaian mRNA sitosolik dan menghambat sintesis protein spesifik, sistem ekspresi sementara dan stabil untuk bentuk protein spesifik tipe liar dan bentuk mutant, dan tikus yang kekurangan protein spesifik. Strategi semacam itu seharusnya membantu kita untuk mengerti fungsi berbagai protein kandidat dalam eksositosis protein saliva dan sebagai konsekuensinya membantu kita untuk menjelaskan keterlibatan potensialnya dalam mekanisme penyakit mulut.