Larutan garam kalsium dan asam fosfat (Ca / P = 1,66 mol) digunakan untuk mensintesis partikel HA dan menggabungkannya pada fibril kolagen sapi tipe I  dengan teknik pengendapan langsung in situ. Teknik ini dioptimalkan untuk menghasilkan 3 rasio komposit Col-HA yang berbeda (20% Col-80% HA; 50% Col-50% HA; dan 80% Col-20% HA) sebagai berikut: kolagen sapi tipe I (Sigma) langsung dilarutkan dalam asam fosfat 0,1 M (H₃PO₄) dan diaduk pada suhu 40°C selama 30 menit, menghasilkan 2,0% (w/w) campuran gel kolagen dalam komposit purna. Larutan Ca/ P 1,66 mol dehidrat kalsium klorida  (CaCl₂) (EMD Chemical Inc) dan asam fosfat (H₃PO₄) (Sigma) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam campuran reagen yang diaduk pada suhu 40°C (Stire & Temp) untuk membisakan endapan HA ke fibril kolagen  sapi tipe I dalam campuran gel. pH campuran diatur antara 8,0 dan 9,0 menggunakan larutan NaOH (J.T. Backer) dan asam hidroklorida (HCl) (Sigma), dan kemudian diturunkan ke pH purna 7,0-7,7. Setelah pematangan dan pem-pra-beku-an pada suhu -20°C semalaman, campuran Col-HA dikeringkan dalam pengering beku (FreeZone, Labconco 117) pada suhu -52°C di bawah tekanan vakum 0,052 mbar selama 24 jam, diikuti dengan pengeringan pada suhu 19°C; 0,97 mbar selama 24 jam. Pengikatan silang dehydrothermal residu kolagen fibril dilakukan dalam oven vakum pada suhu 110°C selama 24 jam. Produk purna komposit kolagen-hidroksiapatit didinginkan hingga suhu kamar. Satu sampel dari setiap produk dipecah untuk mengamati struktur internal menggunakan SEM (Supra 40VP FESEM).

Untuk mengevaluasi properti biologis prototipe komposit Col-HA sebagai perancah, kami melakukan uji kelekatan dan perkembangbiakan MSC secara in vitro. MSC tikus (C₃H₁₀T_1/2) disemai (2 × 10⁵ sel / well) pada 3 rasio komposit Col-HA yang berbeda (20% Col - 80% HA; 50% Col - 50% HA; 80% Col - 20% HA) dalam pelat 12 well dan dikultur dalam Basal Eagle Media (Invitrogen) yang mengandung 100 U / mL penisilin, 0,1 mg / mL streptomisin, dan 10% serum janin sapi dalam inkubator CO₂ dengan 5% karbon dioksida, 95% udara lembab pada 37°C selama 1, 3, 5, dan 7 hari. Bahan pembalut luka kolagen murni tipe I komersial (CollaPlug, Zimmer Inc, Carlsbad, Calif) digunakan sebagai kontrol. Untuk mengamati perlekatan dan perkembangbiakan MSC tikus di bawah mikroskop fluoresensi, sel-sel dikultur dengan transfeksi Adi-GFP (3 μL / mL) semalam.

Komposit 50% Col-50% HA dipilih untuk pengujian lebih lanjut karena memiliki properti mekanik terbaik yang cocok untuk penerapan cangkok tulang. Kami melakukan uji sitotoksisitas menggunakan hPDSC in vitro. Kami menyiapkan dan mengekstraksi larutan dari 4 bahan uji yang berbeda, yaitu: 3 kolagen tipe I murni (CollaPlug; Foundation, OTB, Tokyo, Jepang; dan prototipe kolagen tanpa HA) dan 50% Col-50% HA komposit. Enam sampel dari masing-masing bahan disiapkan. Masing-masing sampel tinggi 5 mm dan diameter 8 mm. Sampel direndam dalam tabung centrifuge 15 mL dengan saline buffered fosfat 10 mL dan ditempatkan dalam inkubator pengocok (Max Q Mini 4000) pada suhu 37°C, 120 rpm selama 48 jam.

Ligamen periodontal manusia dikumpulkan dari molar ketiga yang telah diekstraksi, lalu direndam dalam DMEM dengan 250 μg/mL gentamisin sulfat, glutamin, 5 pμg / mL amfoterisin B, 100 U / mL penisilin, 0,1 mg / mL streptomisin, dan serum janin sapi 10%, PDL dicerna pakai larutan collagenase tipe I (3 mg / mL) dan Dispase ( 4 mg / mL) selama 1 jam.

hPDSC dikultur dengan DMEM yang dilengkapi dengan 100 U / mL penisilin, 0,1 mg / mL streptomisin, dan 10% serum janin sapi dalam inkubator CO₂ dengan 5% karbon dioksida, 95% udara lembab pada 37°C. Menjelang titik pertemuan, sel-sel dilepaskan menggunakan 0,08% trypsin / 0,04% EDTA (pH 7,2) dan bagian 1: 3 ke dalam pelat kultur segar. Bagian keempat hPDSCs (5 × 10⁴ sel / well) disemai dalam culture dish 60 mm dan dikultur dengan 50% larutan sampel yang diekstraksi dan 50% α-MEM termodifikasi yang dilengkapi dengan 100 U / mL penisilin, streptomisin 0,1 mg / mL, dan 10% serum janin sapi dalam inkubator CO₂ selama 1, 3, dan 6 hari. Sel-sel hidup dipanen dan jumlah sel dihitung dengan hemacytometer di bawah mikroskop cahaya. Setiap sampel memiliki 6 jumlah sel duplikat hitung dan rerata dengan SD dihitung. ANOVA diterapkan untuk menilai perbedaan proliferasi sel antara kelompok uji dan kelompok kontrol; nilai P <0,05 dianggap berbeda secara statistik antarkelompok.