Bahan & metode : Prevotella intermedia, periodontitis, asma (2)|palmerah.implantgigi.com

2.3 Diagnosis periodontitis

Individu dengan ≥ 4 gigi dengan ≥ 1 situs yang menunjukkan kedalaman probing ≥ 4 mm, tingkat pelekatan klinis ≥3 mm, serta perdarahan kala probing di situs yang sama dianggap memiliki periodontitis.

Periodontist terlatih (KRS) yang tidak menyadari diagnosis asma setiap peserta, melakukan pemeriksaan oral klinis lengkap yang melibatkan enam situs per gigi, tidak termasuk gigi molar ketiga, menurut parameter periodontal berikut:

jarak antara persimpangan cemento‐enamel dan margin gingival,
kedalaman probing,
tingkat pelekatan klinis,
perdarahan kala probing,
indeks plak.

Keandalan intra‐penguji dinilai dalam 10% sampel. Grafik Bland‐Altman menunjukkan bias mendekati nol untuk pengukuran resesi gusi (0.055) maupun untuk pengukuran kedalaman (0.053).

2.4 Koleksi biofilm subgingiva

Setelah setiap pemeriksaan periodontal, biofilm supragingival dihapus dan pemeriksa yang sama melakukan koleksi biofilm subgingival menggunakan kuret periodontal. Dalam setiap sextant, situs dengan kedalaman probing terbesar dipilih untuk dikoleksi.

Enam sampel dari masing-masing peserta dikumpulkan dalam satu tabung microcentrifuge bebas DNAse dan bebas RNAse yang mengandung larutan steril garam buffer fosfat (PBS) dan disimpan pada suhu −20°C sampai kala analisis. Dengan demikian, untuk setiap peserta, dibuat kelompok biofilm subgingival tersendiri.

2.5 Ekstraksi DNA bakteri

DNA diekstraksi dari setiap sampel menggunakan kolom silika spin sesuai instruksi dari produsen.

2.6 Genotyping bakteri

Kuantifikasi relatif patogen periodontal berikut dalam biofilm subgingival dilakukan dengan reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif (qPCR): Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, dan Treponema denticola (tiga bakteri yang berpartisipasi dalam kompleks merah), Prevotella intermedia (satu spesimen kompleks oranye, terkait erat dengan kompleks merah), dan Aggregatibacter actinomycetemcomitans sangat terkait dengan bentuk penyakit yang lebih agresif.

Urutan probe berikut digunakan untuk mendeteksi semua patogen: 5 '‐6‐FAM‐CRA ACA GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CRC‐BHQ1‐3′. Urutan primer untuk A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola, dan T. forsythia tersedia dalam Tabel 1 tambahan dalam Journal of Periodontology online.

Reaksi dilakukan pada volume purna 12.5 μL larutan berikut: buffer 10× (1.25 μL), yang mengandung 50 mM MgCl₂ (0,38 μL), 4 × 2.5 mM dNTPs (1 μL), 10 μM primer maju (0.38 μL) dan primer mundur (0.38 μL), 5 U/μL Taq (0.05 μL), air bebas RNAse (6.33 μL), probe 10 μM (0.25 μL), dan DNA (2.5 μL). qPCR dilakukan di bawah kondisi berikut: siklus denaturasi tunggal pada suhu 94°C selama 1 menit; 45 siklus pada suhu 94°C selama 20 detik, dan langkah anil purna pada suhu 58°C selama 35 detik.

en	in
PD	Probing depth, kedalaman probing, kedalaman penjajakan
CAL	clinical attachment level, tingkat perlekatan klinis
BOP	Bleeding on probing, pendarahan saat probing/ penjajakan
probing depth	kedalaman probing
clinical attachment level	tingkat pelekatan klinis
bleeding on probing	perdarahan kala probing
probing	penjajakan
PBS	phosphate‐buffered saline, larutan garam buffer fosfat
qPCR	quantitative real‐time polymerase chain reaction, reaksi berantai polimerase kuantitatif kala nyata